印地安纳．琼斯是一所大学的考古学教授，一天，美国军方找到他，他们破译了一份关于“法柜”的德国电报，“法柜”是用来装上帝赐给犹太人“十戒”原文石板的。美国军方派琼斯去开罗先下手为强，他用唯一的测量工具----一个装有红水晶的铜帽和玛润一起找到了“法柜”。 　　一天晚上，琼斯在当地埃及朋友的帮助下，把“法柜”挖掘出来，不幸的是他们被法国考古学家贝勒克发现，德国人抢走了“法柜”，在一座小岛上，“法柜”终于被打开了，这些德国人看到了他们自己不应该看的东西，于是上帝震怒了。“死亡之神”从“法柜” 出来，把所有在场的德国人及贝勒克都击杀了！幸好琼斯和玛润紧闭双眼逃过一劫。后来，琼斯把“法柜”交给了美国军方，“法柜”得到了妥善的保存。

故事发生在《夺宝奇兵3》之后19年，此时二战已经结束，冷战正打的火热。琼斯博士(哈里森·福特饰)已经是年过六十的老者，对钻山洞跳悬崖之类的极限运动却依然兴趣不减。这次他要寻找的宝物是玛雅文明的遗留物水晶头骨，但是一名苏联军队的女特工斯帕科(凯特·布兰切特饰)也盯上了这个有可能成为致命武器的好东西，她在全世界安排了大量手下来干掉琼斯博士。在边找边逃的过程中，琼斯遇到了一名不到20岁的大背头青年马特(希安·拉博夫饰)，马特载着琼斯逃过了苏联人的追击，并决定和琼斯一起去探险。为了得到更多水晶头骨的线索，琼斯博士找到了前女友玛丽昂(凯伦·阿伦饰)，玛丽昂惊讶的发现那个叫马特的青年就是她和琼斯的儿子，而两人对此还毫不知情。 　　就这样，打打闹闹的一家三口在经历了无数危险之后来到了秘鲁丛林，斯帕科率领的特工也一路跟踪来到了这里，双方将在这里展开最后的较量。与此同时，在进入玛雅古墓的时候，守卫水晶头骨的玛雅战士突然出现，把局势搅得更乱，琼斯博士要想带走水晶头骨，几乎就是一项不可能完成的任务……